技術(shù)支持Article
介紹免疫沉淀CHIP的三個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟
點(diǎn)擊次數(shù)：1269 更新時(shí)間：2021-10-23
在生理狀態(tài)下把細(xì)胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起，通過(guò)超聲或酶處理將染色質(zhì)切為小片段后，利用抗原抗體的特異性識(shí)別反應(yīng)，將與目的蛋白相結(jié)合的DNA片段沉淀下來(lái)，以富集存在組蛋白修飾或者轉(zhuǎn)錄調(diào)控的DNA片段，再通過(guò)多種下游檢測(cè)技術(shù)（定量PCR、基因芯片、測(cè)序等）來(lái)檢測(cè)此富集片段的DNA序列。(檢測(cè)相關(guān)技術(shù)服務(wù)：Real-timePCR技術(shù)服務(wù)、基因芯片及結(jié)果驗(yàn)證服服務(wù)、高通量測(cè)序及結(jié)果驗(yàn)證服務(wù))
免疫沉淀CHIP技術(shù)實(shí)驗(yàn)步驟
染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)包括3個(gè)獨(dú)立的步驟，即固定、沉淀和檢測(cè)。
1、固定
甲醛能有效的使蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)-DNA，蛋白質(zhì)-RNA交聯(lián)，形成生物復(fù)合體，防止細(xì)胞內(nèi)組分的重新分布。首先在體內(nèi)用甲醛固定DNA和蛋白質(zhì)復(fù)合物，需要注意甲醇的交聯(lián)時(shí)間，如果過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎，影響ChIP結(jié)果，而且實(shí)驗(yàn)材料也容易在離心過(guò)程中丟失；交聯(lián)時(shí)間如果過(guò)短，則交聯(lián)不*，產(chǎn)生假陰性。交聯(lián)反應(yīng)可加入甘氨酸終止。然后用化學(xué)（微球菌酶）或者機(jī)械（超聲波）的手段將其隨機(jī)切成一定長(zhǎng)度的染色質(zhì)小片段（200～1000bp）。
2、免疫沉淀
利用目的蛋白質(zhì)或者目的蛋白質(zhì)上標(biāo)簽的特異性抗體，通過(guò)抗原和抗體反應(yīng)形成DNA－蛋白質(zhì)－抗體復(fù)合體，然后沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段。
3、目的片段的純化與檢測(cè)
經(jīng)過(guò)熱處理及交聯(lián)，釋放共沉淀的DNA；再將DNA片段純化后，對(duì)沉淀的DNA樣品進(jìn)行檢測(cè)。目前檢測(cè)方法主要有3種：第1種是比較沉淀的模版與陰性和陽(yáng)性對(duì)照PCR信號(hào)強(qiáng)度的普通PCR實(shí)驗(yàn)，或者相對(duì)精確的定量PCR方法。第2種是將沉淀的DNA與DNA微陣列芯片雜交（ChIP-on-ChIP），以檢測(cè)多基因軌跡全部的相互作用。第3種是高通量DNA測(cè)序分析。
