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pBM16A Toposmart Cloning常見問題分析
點擊次數(shù):1146 更新時間:2021-04-06

pBM16A Toposmart Cloning Kit

 

產(chǎn)品信息:

 

組 成

YCL071-01

YCL071-02

pBM16A Vector (20ng/ml )

20ml

20ml×3

10×Toposmart

20ml

20ml×3

Control Insert

5ml

5ml

M13F Primer

0.1OD

0.1OD×3

M13R Primer

0.1OD

0.1OD×3

 

保存條件:-20℃保存,有效期一年。產(chǎn)品介紹:
 
pBM16A Toposmart克隆試劑盒利用痘苗病毒的拓撲異構(gòu)酶I(Topoisomerase I)的切割再連接的特點將片段克隆到載體中。不僅適用于克隆由Pfu、KOD、Xerox、Phusion 和Q5等高保真DNA聚合酶擴增的平末端PCR產(chǎn)物,也可克隆由Taq、Tth和klenTaq等DNA聚合酶擴增的帶A尾的PCR產(chǎn)物。試劑盒中的pBM16A載體為線性化的質(zhì)粒。可以用引物對M13F和M13R進行菌落PCR鑒定陽性克隆。
 
產(chǎn)品特點:
 
(1)連接反應(yīng)僅需5 分鐘。
 
(2)適用于平末端PCR產(chǎn)物和帶A尾的PCR產(chǎn)物。
 
(3)載體采用了新的制備工藝,無需藍白斑篩選。
 
(4)克隆位點兩旁都有Smal和EcoR V酶切位點,適合單酶切鑒定。
 
(5)載體具有氨芐青霉素抗性。
 
操作步驟:
 
1.連接反應(yīng)
 
按下表,在一個0.2ml PCR 管中依次加入
 

成分

體積

DNA *#片段

0.5-8µl

pBM16A Topo載體

1ml

10×Toposmart

1ml

補水至總體積

10ml

 
 
加完試劑后,輕輕混勻低速離心,使溶液集中在管底。
 
注意:此步驟不要在低溫條件下(冰水浴)上操作。
 
2.反應(yīng)溫度及片段要求
 
室溫下(20-30℃)放置 0-5 分鐘,然后將離心管放置在冰上。如當天不進行轉(zhuǎn)化實驗。請將連接產(chǎn)物置于-20℃保存。
 
注意:DNA *#片段的用量見下表
 
 

片段大小(bp

建議用量(ng

100-1000

20-50

1000-2000

50-100

2000-5000

100-200

 
室溫下(20-30℃)反應(yīng)時間 5-30 分鐘,如果室溫較低,推薦使用 PCR 儀器控制溫度。可以設(shè)置 25℃反應(yīng) 5 分鐘。如果 PCR 產(chǎn)物電泳檢測僅有很銳利明亮的條帶,無引物二聚體和非特異性條帶存在,可直接取 0.5-1µl PCR 產(chǎn)物原液進行克隆。
 
3.陽性對照反應(yīng)
 
取1µl 試劑盒提供的1kb長度的對照片段LacZ 基因α肽片段進行克隆,轉(zhuǎn)化具有α 互補功能的大腸桿菌感受態(tài)細胞(如 DH5α,*0,Mach1-T1 等)。菌液涂布在含有IPTG,X-gal 的LB 氨芐平板上,次日藍色菌落為陽性克隆,說明有片段插入,白色菌落為空載體。
 
4.轉(zhuǎn)化
 
1.取5µl 連接產(chǎn)物到50-100µl 剛剛?cè)诨母惺軕B(tài)細胞中,輕輕混勻,冰浴2-30 分鐘。
 
2.42℃水浴中熱擊30 秒鐘。
 
3.立刻置于冰水浴中2 分鐘。
 
加入300-500µl 無菌的不含抗生素的SOC 或LB,37℃,200-250rpm 振蕩培養(yǎng)60 分鐘。
 
注:小于 2kb 片段可以不復(fù)蘇,直接涂平板。
 
4.吸取200µl 菌液涂布。為了得到更多的菌落,可以先4000rpm 離心1 分鐘,去掉部分上清,用移液器輕吹菌體,充分懸浮菌液,取全部菌液涂布,然后 37℃培養(yǎng)過夜(12-16 小時)。
 
5.陽性重組子的鑒定菌落 PCR
 
(1)菌落PCR方法鑒定陽性克隆
 
① 用10l吸頭挑選克隆至預(yù)先加有10μl無菌水或LB培養(yǎng)基的PCR管中,吹打混合。
 
② 25l PCR反應(yīng)體系:取2μl細菌懸液為模板、加入5μM 濃度的M13F/M13R各
 
1μl進行PCR擴增。
 
③PCR擴增條件:95℃預(yù)變性5分鐘(裂解細胞,失活核酸酶),94℃變性10秒鐘,55℃退火10秒鐘,72℃延伸( 根據(jù)片段的大小決定延伸時間,通常每1min/1kb)X秒,30個循環(huán),72℃后延伸5分鐘。1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結(jié)果,有強烈的明顯條帶的克隆為重組體,與插入片段大小相近(M13F/M13R 引物在克隆位置的兩側(cè),所以PCR擴增出的DNA的長度比插入片段大138bp) 可視為陽性克隆。菌落PCR方法鑒定重組子時一定要設(shè)立一個不加菌液的陰性對照。
 
(2)測序:用M13F、M13R通用引物對陽性質(zhì)粒進行測序分析。
 
pBM16A載體圖譜
 
常見問題分析
 
重組子克隆菌少,或陽性率低:
 
(1)感受態(tài)效率低,使用轉(zhuǎn)化效率>5×107cfu/µg 的感受態(tài)細胞
 
(2)連接反應(yīng)在低溫下(如放碎冰上)操作,應(yīng)該在室溫下操作。
 
(3)PCR 片段加入量太多或太少,按照推薦量加入。
 
(4)PCR 純度低,重新擴增或重新純化PCR 產(chǎn)物。
 
(5)PCR 質(zhì)量低,切膠時在紫外下照射時間長,需重新制備。
 
(6)PCR 擴增結(jié)束后,應(yīng)該再延伸 5-10 分鐘,確保片段延伸*。
 
(7)轉(zhuǎn)化后沒有復(fù)蘇培養(yǎng),可以加入 SOC 或LB,培養(yǎng) 60 分鐘。
 
(8)克隆基因可能對宿主菌有毒性,比如某些編碼膜蛋白和 DNA 結(jié)合蛋白的基因, 某些啟動子和調(diào)節(jié)序列基因,或含有倒置或串聯(lián)重復(fù)序列的基因,選用室溫過夜培養(yǎng)平板。
 
載體序列:
 
>pBM16A Topo AGTGAGTTGATTGTGTAAAACGACGGCCAGTGTCTGAGGCTCGCTTCAGTCCTGATGCTTGATATCCCGGGCGT GTCGCCCTT$$$$AAGGGCGACACGCCCGGGATATCGCGTCTGCCTGAAGTCAATACTGACGATGGTCATAGCT GTTTCCTGTCCATAGCAGAAAGTCAAAAGCCTCCGACCGGAGGCTTTTGACTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCC AACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGA AGCTAAAATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCACTTATTCCGTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTG CTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTG GATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGT TCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTC AGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGC AGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCT AACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCA TACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAA CTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCG CTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGCTCTCGCGGTATCATTG CAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGAT GAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAATGAGGGCCCAAATGTAATCA CCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATC ACAAAAATCGATGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGA AGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAG CGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTG TGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGA CACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGA GTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAG TTACCTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTT GCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATTTTCTACCGAAGAAAGGCCCAC CCGTGAAGGTGAGCC
 
本產(chǎn)品僅供研究不用于臨床診斷
 

 

實驗代做服務(wù):

 

免疫組化IHC染色實驗服務(wù)

細胞、組織TUNEL凋亡染色實驗服務(wù)

試劑盒免費代檢測

實驗室代做實驗項目

 

透射電鏡服務(wù)實驗服務(wù)

石蠟/冰凍切片TUNEL凋亡

核仁組成區(qū)嗜銀-AGNOR染色實驗服務(wù)

免疫共沉淀(CHIRP)實驗

RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RIP)實驗代做

酶聯(lián)免疫(ELISA)技術(shù)服務(wù)

雞傳染性法氏囊病病毒VP2抗體診斷試劑盒

喹諾酮類快速檢測試劑盒

組織芯片/微陣列定制技術(shù)服務(wù)

 

染色質(zhì)免疫沉淀分析(CLIP)實驗服務(wù)

 

多因子液相芯片技術(shù)(Luminex)實驗

免疫細胞化學(xué)ICC實驗服務(wù)

ATP/ADP檢測實驗服務(wù)

蛋白雙向(2-D)電泳實驗服務(wù)

蛋白相互作用分析

堿性磷酸酶染色實驗服務(wù)

PKC活性檢測實驗

非標定量實驗

(Label-free)

 

DIGE技術(shù)實驗服務(wù)

端粒酶活性檢測實驗

細胞生長曲線的測定

掃描電鏡服務(wù)

NF-KB p65活性檢測實驗

 

慢病毒包裝實驗服務(wù)

滬公網(wǎng)安備 31011802001676號

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